點亮你的細胞! 免疫螢光 (IF) 抗體選擇全方位指南

by on May 23,2023

實驗結果好不好,抗體選擇佔一半,所以擁有一支優秀且合適的抗體,是獲得免疫螢光美圖的關鍵,ABclonal 結合多年免疫學經驗,今天本文送上一份免疫螢光抗體選擇攻略,幫助實驗夥伴的你,輕鬆拿到漂亮的 Data !

免疫螢光原理及應用

免疫螢光(Immunofluorescence,IF)主要原理是利用螢光標記的抗體作為探針對組織或細胞內的特定蛋白進行定位和定性分析,由於其具有特異性強、敏感性高、速度快等優點,因此廣泛用於科學研究與臨床診斷上。

 

免疫螢光兩大方法

01 直接法 (Direct) 免疫螢光染色

將兩種針對不同蛋白且標記有兩種不同螢光素的抗體適當比例混合,和樣本進行反映,之後洗去未與樣本結合的螢光抗體,在螢光顯微鏡下觀察,即可對兩種蛋白進行定位和定性分析。

 

02間接法 (Indirect) 免疫螢光染色

將無標記螢光的兩種特異性一抗(需要不同物種來源)按順序和組織或細胞反應,洗去多餘的一抗後,再用兩種辨識不同物種且不同的螢光素標記的二抗與組織或細胞反應,在洗去多餘的二抗後,利用螢光顯微鏡觀察,從而對兩種蛋白進行定位和定性分析。

本文從實驗時間、複雜性、靈活性、敏感性、物種交叉反應性和背景值等方面進行了比較:

 

 

免疫螢光-抗體選擇法則

如果只需要觀察兩個蛋白在細胞中的表達情況,可建議選擇直接進行染色,可以相對減少二抗交叉反應的風險也可節省實驗時間。

但目前大多數實驗室主要還是用間接法來研究多個目標蛋白在細胞中的表達狀況,所以我們今天重點介紹間接法免疫螢光應該要麼選擇適合的抗體呢?

 

一抗選擇指南

首先根據樣本物種選擇適合抗體,一抗宿主應盡量選擇與檢測樣本不同來源,進而避免二抗與樣本內源性免疫球蛋白(Igs)產生交叉反應。

例如:檢測小鼠樣本,則盡量避免選擇小鼠或大鼠來源的一抗(如果只能選擇同物種一抗,建議加個Isotype對照),最好選兔子來源的一抗,則二抗則可選擇帶有不同螢光的Anti-rabbit IgG。

 

 

二抗選擇指南

1. 根據一抗的物種選擇

如一抗是小鼠來源,二抗就必須選擇抗小鼠二抗(Ex: Goat anti-mouse);如果一抗是兔子來源,那就選抗兔子的二抗(Goat anti-rabbit)

 

2.根據抗體類型與亞型選擇

1)一抗若為單株抗體

二抗應針對一抗的類型或亞型選擇。

例如,在同時使用 IgG1 和 IgG2 的一抗進行免疫螢光雙染實驗中,使用抗 IgG1 和抗 IgG2 二抗是更佳的選擇。

 

2)一抗若為多株抗體

可以直接選擇 IgG 二抗,因為大多數多株抗體是 IgG 類免疫球蛋白

 

3.根據二抗的類型

胸腺、脾臟、血液的組織以及造血細胞、淋巴細胞、B細胞等細胞貨組織樣本表達較高的 Fc 受體,全長二抗的 Fc 端容易與 Fc 受體結合,因此,針對上述類型的樣本,選擇 F(ab)2 片段抗體可以避免非特異性結合。

 

4.根據二抗的純化方式

經交叉吸附處理的二抗在純化後再次通過固定了其他種屬的血清或抗體的純化柱,降低種屬間交叉反應,在多色分析具有突出的優勢。

 

5.根據螢光基團

目前常用的螢光標記有 FITC、PE、Cy3、Alexa Fluor 系列及 ABflo® 系列等。

多螢光染色需要綜合考慮各蛋白在細胞中表達豐富度和各螢光的信號強度,盡可能讓低豐度蛋白搭配強螢光,高豐度蛋白搭配弱螢光,讓二者訊號處於平衡。

 

免疫螢光抗體小QA

1. 為什麼我的抗體可以做 WB ,卻不能做 IF 實驗呢?

您的這個抗體很可能是透過 Peptide 免疫而得到的,這段 Peptide 剛好被包裹在蛋白質的中心,因此只能辨識 WB 中線型的蛋白,所以在實驗中還是需要注意抗體是否滿足該實驗以及需要進行一定的條件測試。

 

2. WB 和 IF 的二抗是一樣的嗎?

當然不是呦! 偶連到二抗上的探針主要有酶(如:辣根過氧化酶 HRP 和鹼性磷酸酶 AP 或其衍生物 APAAP,PAP),螢光基團(FITC、Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine等)、Biotin等。WB 實驗中的二抗一般是 HRP 或鹼性磷酸酶(AP)等標記抗體,需借助 Substrate(如 ECL)通過化學發光法呈色。而用於免疫螢光實驗的是螢光基團標記的抗體,結果需要透過螢光激發並利用螢光顯微鏡進行觀察。

 

這些免疫螢光染色的小祕訣大家都Get 到了嗎?希望這些方法可以幫助小夥伴們實驗更順利,一起點亮你的細胞,讓它綻放屬於自己光芒 !

 

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